CRCM02001-1L CellBayTM 293 CM21 Medium（293细胞基础培养基）

 

使用说明书

 

简介

CellBay™ 293 CF21 Medium 是一款针对人类胚胎肾细胞293(HEK293)和其衍生细胞系瞬时表达所研发的无血清、成分确定的培养基。适用于 HEK293系列细胞的悬浮培养以及瞬时化学转染。该培养基可以实现293细胞的复苏、传代、冻存、转染.

组分

含：L-谷氨酰胺丨次黄嘌呤&胸苷丨 碳酸氢钠

不含： 酚红丨水解产物丨   

葡萄糖：6.0g/L            

产品用途

在处理或补充培养基时使用无菌技术。本产品用于研究或进一步制造使用。

警告：不用于人类或动物治疗用途。超出规定范围的使用可能会触犯当地法律。

安全信息

阅读物料安全数据表(MSDS)并依据相关的安全操作规范，佩戴护目镜，洁净服，口罩和手套等。

用前准备

•293 CF21 的使用需要无菌；

•产品含L-谷氨酰胺；•不推荐使用抗生素；

•开封后未用完的培养基应进行分装，使用封口膜封口，在2~8℃避光干燥保存。

补料建议

如果项目已经有比较成熟的培养工艺，建议参照原工艺进行，若是工艺开发阶段，建议使用 DOE 的方法来确定合适的培养参数，以便得到更好的结果。常用补料工艺，转染后Day1补4-8%的 293 CF21或者Day1,3补4%的 293 CF21或者不用补料。

培养条件

·培养基：CellBay™ 293 CM21 Medium

·细胞系：HEK293、HEK293T、HEK293F、HEK293FT

·培养类型：悬浮

·培养容器：摇瓶/TPP/反应器温度范围：37℃+0.5℃

·培养箱气体要求： 5%~8% CO₂ 的加湿培养

注意：确保适当的气体交换和最小化的曝光培养。

细胞驯化

少数HEK293细胞因长期适应原培养条件，需要经过一个简单的顺序驯化过程来适应。

从原培养体系向293 CM21驯化之前务必确保细胞处于对数生长中期且活率>90%。

直接接种

将悬浮培养细胞转移到293 CM21中,如下：

1、1000rpm离心细胞悬浮液3~5分钟。吸出丢弃上清液：

2、以5x10⁵cells/ml 的活细胞密度将细胞沉淀重悬于预热的293 CM21中并转移至合适的培养容器;

3、放回摇床并监测细胞生长。

注意：如果使用直接接种方法观察到细胞生长或转染效率不理想，则使用顺序驯化方法。

顺序驯化

按照以下程序进行细胞悬浮培养的步骤：

1、 使用5x10⁵cells/ml 的接种密度；

2、逐步调整 293 CM21与原始培养基的细胞培养比例(25:75， 50:50，75:25， 90:10，然后是100%   293

CM21）。每个步骤视情况可多次传代;

3、在100%  293 CM21中几次传代后,活细胞密度应超过2x10⁶cells/ml，倍增时间约24~30h,培养3~6天内存活率≥85%。至此，细胞即已适应293  CM21请按以下步骤冻存细胞备用。

冷冻保存

1、准备好所需数量的细胞，且细胞状态较好，以90%  293 CM21+10% DMSO的混合液作为冷冻保存培养基，并储存于2~8°直至使用；

2、使用自动细胞计数仪或其它计数仪器进行细胞计数，根据最终冻存密度计算出冷冻保存培养基所需的体积，建议冻存密度为(1~1.5)×10⁷ cells/ml;了、通过1000rpm离心5分钟收获细胞，丢弃上清液，用适量冷冻保存培养基重悬细胞至冻存密度；

4、根据规格立即将细胞悬浮液的分裝到冻存管中;

5、按照标准程序，在自动或手动控制速率冷冻设备中实现冷冻保存。将冷冻细胞转移到液氮或-130℃以下保存。

注意：在液氮或-130℃以下储存24小时后，取出一只冷冻保存细胞进行复苏，检查活率及其它指标。请参阁 “细胞复苏”

细胞复苏

1. 细胞从液氮罐中取出，迅速在37℃水浴中快速解冻至细胞融化，过程约1~2分钟；

2. 将细胞液转移至5ml预热的293 CM21，吹打均匀，1000rpm离心5分钟，丢弃上清液;使用5ml  293 CM21重悬：

3.使用自动细胞计数仪或其它计数仪器进行细胞计数，根据需要的细胞密度吸取细胞液至125ml摇瓶，加入适量293  CM21,使细胞达到所需复苏密度，建议复苏密度为(3~5)×10⁵cell/ml;

4. 在含有5%CO₂，37℃的培养箱或摇床进行培养；

5. 细胞复苏后培养2~5天处于对数生长中期时传代。在进行其它实验之前，复苏的细胞至少应进行三次传代。

细胞传代

1.使用自动细胞计数仪或其它计数仪器进行细胞计数，根据需要的接种密度计算所需细胞原液体积，建议接种密度为(3~5)×10⁵cells/ml；

2. 将所需量细胞原液加入到含有 293 CM21的摇瓶中,使细胞达到所需接种密度;

3. 继续置于5%CO₂，37℃的培养摇床中培养，通常2~3天后可进行下一次传代。

推荐的转染条件

最佳转染条件应根据具体情况进行优化，并可能需要通过DOE方法确定。以下转染条件仅供参考。

VCD：2~4*10⁶cells/ml，活率≥95%

DNA： 1~1.5mg/L

PEl：2~6 mg/L

转染和瞬时表达的推荐方案

转染前1天	第1步	扩增HEK293细胞，直至密度达到约3~4*106cells/ml，活率≥95%，
	第2步	转染前一天，将步骤 1中的细胞按推荐的细胞密度接种，并使细胞生长过夜。
转染当天	第3步	在转染当天，获取包括细胞密度和存活率的数据。细胞应达到建议的密度。进行转染的细胞活率应≥95%。如果细胞密度过高，请使用新鲜的培养基将细胞稀释至推荐的细胞密度。注意：丢弃剩余的细胞；不要重复使用高密度细胞进行常规传代培养。
	第4步	用培养基稀释质粒DNA。通过旋转或翻转试管混匀。
	第5步	将PEI 管轻轻翻转4至5次以充分混匀。并用培养基稀释PEl。通过旋转或翻转试管来混合。
	第6步	将稀释后的 PEI 加到稀释后的质粒 DNA 中。旋转或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2至 3次进行混合。将复合物在室温下孵育约 20 分钟。
	第7步	将复合物缓慢添加至步骤 3的细胞摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。
	第8步	将摇瓶放回 37℃培养箱中按日常条件培养。
转染第2天	第9步	转染第2天，在转染后 16-22 小时向摇瓶中添加 4-8%   293 CF21，在添加过程中轻轻晃动摇瓶。将摇瓶放回 37℃培养箱。
转染第3-6天	第10步	在瞬时表达过程中，维持葡萄糖浓度在 4g/L以上。当细胞活率低于 60%时收获细胞。

 

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