低内毒素质粒提取试剂盒 CR-NAE-001
产品名称：低内毒素质粒提取试剂盒
货号： CR-NAE-001
规格： 50T/盒，彩色低内毒素质粒小提试剂盒
存储条件： 部分4℃和-20℃，其余室温，避光
有效期： 一年
仅科研使用 Research Use Only
产品简介
本试剂盒可以从大肠杆菌中有效提取大量低内毒素含量的、高质量质粒，每个DNA纯化柱最高能承载140μg的质粒，内毒素含量远低于8 EU/μg（所接触的试剂耗材均为普通的试剂耗材，非无内毒素处理的特殊试剂耗材），足以满足细胞转染用质粒内毒素含量标准（＜50EU/μg）。而且操作简单，再加上特殊的颜色显示，可以更加清晰准确地显示操作是否符合要求，以此来保准每批次质粒提取的稳定性和可靠性。
产品组分
RNase A；1.5mg；-20℃
预处理缓冲液；12mL；室温
重悬缓冲液；15mL；室温
裂解缓冲液；15mL；室温
中和缓冲液；10mL；室温
内毒素结合液；4mL；4℃
洗涤缓冲液；20mL；室温
洗脱液；6mL；室温
DNA吸附柱；50T；室温
使用方法
- 取出含有目的质粒的甘油菌50μL，将其接种到含有相应抗生素的LB培养基中，37℃ 220rpm/min摇床培养20h以上；
- 用2mL离心管收集细菌菌体，室温13000×g离心1min，弃去上清，每管收集5~10mL菌液的菌体；
- 空管瞬时离心，吸去残留的培养基；
- 取1mL重悬缓冲液加入到RNase A管中，充分溶解后再将其移回重悬缓冲液中，轻轻颠倒混匀，注意防止动作太过剧烈而产生气泡；
- 取250μL加入RNase A的重悬缓冲液于离心管中，用移液枪将菌体沉淀挑起并反复吹打使其充分分散，其余重悬缓冲液要置于4℃保存；
- 取250μL裂解缓冲液于离心管中，盖上管盖后不断地轻轻颠倒混匀，使菌体充分接触裂解试剂而裂解细胞，待菌液从白色变成毛玻璃的半透明且粘稠时，静置1~2min；
- 取150μL预冷的中和缓冲液于离心管中，然后盖上管盖迅速颠倒混匀。刚加入中和缓冲液后，部分溶液由红色变成黄色，此时轻轻地颠倒混匀，使溶液以及沉淀全部由红色变成黄色，而后再快速震荡将大团块沉淀打散成蛋花状，使质粒充分释放出来；
- 室温13000×g离心15min，将上清小心地转移至1.5mL无菌离心管中（约600μL），然后从冰箱中取出内毒素结合液，加入1/10体积的内毒素结合液。轻轻颠倒混合，此时溶液变得浑浊。
- 将混合液置于冰中孵育10min，每隔2min颠倒混匀1次，溶液由浑浊逐渐变得澄清透明；
- 孵育完成后，将离心管置于42℃金属浴中静止孵育5min，期间勿搅动混合液，溶液由透明变得浑浊；
- 取出离心管并置于离心集中，室温13000×g离心10min；
- 小心地取出离心管，此时溶液分为上下两层，上层无色透明液体即为质粒溶液，下层绿色液体即为内毒素溶液，小心地将上层清液转移至1.5mL无菌离心管中（约600μL），加入1/2体积的异丙醇，充分混合均匀。如果是高拷贝的质粒，此时溶液中会出现絮状沉淀，这是质粒DNA凝集的结果，切勿丢弃；
- 取出DNA吸附柱，向其中加入200μL预处理缓冲液，室温13000×g离心30s，弃去滤液；
- 取质粒溶液加入到DNA吸附柱中，静置1min后，室温13000×g离心30s，弃去滤液；
- 重复步骤14直至质粒溶液完全通过DNA吸附柱；
- 取80mL无水乙醇加入到洗涤缓冲液中，混合完全后，取700μL洗涤缓冲液加入到DNA吸附柱中，室温13000×g离心30s，弃去滤液；
- 重复步骤16再洗涤一次；
- 将DNA吸附柱置于离心集中，室温13000×g离心3min；
- 将DNA吸附柱转移至1.5mL无菌离心管中，打开盖子室温挥发5min；
- 取100μL洗脱液加入到硅胶膜上，室温静置5~10min；
- 室温13000×g离心30s，将滤液吸出后再将其重新加到硅胶膜上，室温13000×g离心1min，将滤液转移至新的1.5mL无菌离心管中，弃去DNA吸附柱；
- 测量浓度后，电泳鉴定所提质粒的纯度和质量，标记好相应的信息，保存在-20℃环境中
注意事项
- 所提质粒的量和浓度会根据质粒的紧密类型而有所不同；
- 想要尽可能多地获取更多质粒，需要在培养时尽可能保证充足的供养，用通气性更好的广口瓶、纱布封口、保持高转速等手段都会显著提高质粒的产量；
- 为了获得更多的质粒，在将质粒溶液通过DNA吸附柱时可以多次离心，让溶液中的质粒充分结合到硅胶膜上；洗脱时可以增加洗脱次数，一般反复洗脱4次时可以将绝大多数质粒洗脱下来；
- 中和缓冲液如果变红，或者步骤7加入中和缓冲液混匀后溶液不是黄色，则说明中和缓冲液已经失效，不可再用；
- 裂解缓冲液在低温下容易产生沉淀，此时应在60℃培养箱中孵育一段时间，待沉淀完全消失后轻轻混匀后再使用；
- 大肠杆菌培养时间过短会导致质粒的复制中间体、开环条带的占比增加，为了尽可能获得更多的超螺旋质粒，应保证细菌培养时间在20h以上；
- 如果所提质粒中RNA含量较高，说明重悬缓冲液中的RNase A已经失活，此时应该重新加入RNase A，使其浓度在100μg/mL的浓度；
- 如果只想提取普通的质粒，可将内毒素结合液处理步骤除去，但此时RNA含量可能会偏高，应将裂解液置于37℃孵育5~10min之后，再按照步骤12之后的步骤进行提取操作。
质量保证
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购买信息
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货号 |
产品规格 |
官网价 |
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CR-NAE-001 |
低内毒素质粒提取试剂盒 |
300 CNY |
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